이번 글은 질량 분석법에 대하여 마지막으로 소개하는 글입니다. 지난 2개의 글로 질량 분석법의 기본 단위체들의 원리와 종류에 대해서 살펴보았다면, 본문에서는 복잡한 혼합물에 대한 정밀 분석이 가능하게 하는 직렬 질량 분석법(MS/MS)에 대하여 알아보겠습니다.
▣ MS/MS
MS/MS는 표기 대로, 두 단계의 MS를 사용하는 분석법입니다. 첫번째 MS에서 원하는 m/z값의 이온을 분리하고, 분리된 이온(parent ion or precursor ion)은 화학반응을 거치면서 m/z값의 변화를 거쳐 다음 MS에서 더 정밀한 분석을 수행합니다. 화학 반응을 거쳐 분해 생성된 이온들을 생성 이온(product ion)이라고 하며, 이들이 두번째 MS에서 검출됩니다. MS/MS의 분석과정을 수식으로 나타내면 다음과 같이 표현할 수 있습니다. (mp=parent ion, md=product ion, mn=neutral fragment)
MS/MS의 기본 개념은 크로마토그래피와 결합하여 사용하는 MS(LC/MS, GC/MS 등)와 유사합니다. 그러나 LC/MS의 경우 크로마토그래피 컬럼에서 용출된 분석물에 의존적이기에, MS가 LC에 종속된 변인으로서 작용하는 분석방식이라면, MS/MS는 각각을 독립된 변수로서 조작하여 분석할 수 있다는 강점을 갖고 있습니다. LC/MS와 달리 MS/MS에서만 가능한 분석도 있습니다. 복잡한 혼합물에서 특정 물질 유형만을 빠르게 스크리닝할 수 있다는 것입니다. 대표적인 예로, 펩타이드 혼합물의 당화(glycosylation) 여부 확인 뿐만 아니라, 펩타이드의 인산화(phosphorylation) 여부 또한 확인할 수 있습니다.
분리 이온(parent ion) 스캔과 생성 이온(product ion) 스캔 모두 신약 개발에서 중요한 역할을 수행합니다. 비슷한 핵심 구조를 갖고 있지만 다양한 변주가 존재하는 물질의 경우, 잠재적 치료능에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 동족 계열 중 가장 뛰어난 치료능을 가진 물질 구조를 찾는 데에 일조할 수 있습니다. 스크리닝을 통해 밝혀지지 않은 대사체를 분석해내기도 하고, 물질 사이의 화학 반응의 모니터링도 수행할 수 있습니다.
단일 MS와 비교했을 때, MS/MS는 signal/noise가 개선된다는 강점을 갖고 있습니다. 대부분의 단일 MS에서 사용하는 검출기의 경우 단독 이온의 영향을 받을 수밖에 없는데, 이 때문에 검출기 노이즈가 아닌 실제 이온으로부터 방출된 백그라운드의 노이즈로 인해 분석 정확도에 방해를 받게 됩니다. 이러한 노이즈를 화학적 노이즈라고 하며, 검출의 한계로 작용합니다.
그러나 MS/MS에서는, MS1이 화학적 필터가 되어 타겟하는 m/z값 이온 외의 다른 질량 스펙트럼의 이온을 제거할 수 있습니다. 따라서 MS2에서 생성 이온을 분석할 때 나타나는 노이즈는 화학적 노이즈가 아닌 검출기의 노이즈로 판단할 수 있고, 이는 화학적 노이즈보다 적은 수준이기의 분석의 신뢰도를 높일 수 있습니다.
▣ 분리법 (Dissociation methods)
MS/MS의 성능을 결정하는 또 하나의 포인트는, 두 MS 사이에서 일어나는 반응입니다. 가장 일반적으로 일어나는 반응은 단분자 분해반응으로, 이온 활성화에 의해 촉진됩니다. 이온 활성화를 통해 분리 이온의 내적 에너지를 증가시켜 MS2에 진입하기 전에 이온의 분해를 일으켜 생성 이온을 발생시키기 때문에, 이온 활성화는 곧 이온의 분리법이라고 말할 수 있습니다.
대표적인 분리법으로는 충돌 유도 분리법(Collision-induced dissociation, CID)이 있습니다. CID에서는 분리 이온이 중성 기체와 충돌함으로써 분리 이온의 내적 에너지 증가, 분해를 통해 생성 이온을 발생시키는 원리입니다. CID는 모든 MS에서 사용되는 방법이지만, 특정 기기들에서 사용되는 다른 분리법도 존재합니다. 다른 분리법으로 표면유도분리법(Surface-induced dissociation, SID)와 광분리법(photodissociation)이 있습니다. 초기 광분리법의 경우 UV나 가시광선 레이저를 사용했지만, 효율성을 높이기 위해 적외선을 사용한 다중 광분자 분리법(IRMPD)가 개발되어 사용되고 있습니다.
▣ MS/MS 기기
MS/MS 기기는 Tandem-in-space, Tandem-in-time의 두 종류로 구분합니다. Tandem-in-space는 각각의 MS에서 개별 분석기가 필요하고, beam 유형의 분석기가 주로 사용된다는 특징이 있습니다. 이와 달리 trap 유형의 분석기는 tandem-in-time에서 사용하며, 각 단계가 같은 분석기에서 진행되지만 시간차를 두고 분석됩니다. 이러한 특징 덕분에, tandem-in-time는 하나의 분석기로 여러 단계의 MS를 분석할 수 있다는 장점을 갖고 있습니다. 대신, 분리 이온 스캔이나 중성 손실(neutral-loss) 스캔은 어렵습니다. 따라서, 복잡한 혼합물의 스크리닝을 위해서는 beam 기반 기기를 사용하는 것이 좋습니다.
가장 초기의 MS/MS 기기는 두 단계에서 모두 sector를 사용했지만, 곧 triple quadrupole(QqQ)이 개발, 사용되었습니다. QqQ의 경우 기존의 sector 기반 MS/MS보다 저렴하고 작동법이 쉬워 빠르게 보급되었습니다. QqQ 기기에서는 첫번째와 세번째의 quadrupole이 MS로서 작동하고, 중간 quadrupole은 CID를 위한 collision 구획으로 나뉩니다.
이 후 개발된 기기들은 서로 다른 유형의 기기들을 연결시켜 하이브리드로 사용하기도 합니다(Q-TOF 등). 현재 많이 사용되고 있는 tandem-in-space 기기들은 QqQ 또는 Q-TOF를 가장 많이 사용합니다. Q-TOF는 펄스형 장비이기 때문에 스캐닝은 불가능하지만, 빠른 분석이 가능해 LC/MS/MS로 많이 사용합니다. 스캐닝을 위해서는 QqQ 장비를 사용할 수 잇습니다.
Tandem-in-time 장비인 quadrupole ion trap, FTICR 기기는 이온들이 다음 단계의 분석기로 이동할 필요가 없고, time frame으로 작동하여 분리 이온이 분해될 시간을 충분히 확보하기 때문에 높은 MS/MS 효율을 갖고 있습니다. 특히 quadrupole ion trap의 경우 MS/MS 실험이 훨씬 간단하고 빠르게 구현된다는 장점과, 상대적으로 작은 장비의 크기, 저비용이라는 점 때문에 가장 많이 사용되는 기기이기도 합니다.
지금까지 총 3편의 글로 나누어 MS의 기본 원리부터 각 단위체의 역할과 종류, 그리고 MS/MS 분석법의 장점과 장비의 분류까지 정리했습니다. 질량분석법은 기능 범위가 넓어, 신약 후보 물질의 발견부터 품질 관리까지 다양하게 적용될 수 있기에 신약 개발 분야의 핵심적인 도구로 사용될 것으로 기대됩니다.
참고 : Glish, G., Vachet, R. The basics of mass spectrometry in the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov 2, 140–150 (2003). https://doi.org/10.1038/nrd1011