단클론 항체(monoclonal antibody)를 포함해, 바이러스 벡터(viral vector)와 같은 생물학적 제재를 정제하는 공정에서 충진 컬럼을 이용한 크로마토그래피(Pakced-bed chromatography)를 사용하는 것은 필수적입니다. 일반적 방식의 크로마토그래피 컬럼의 경우, 다공성 미립구(porous microsphere)를 실린더형 컬럼(cylindrical column)에 충진하여 크기, 전하, 소수성을 이용해 정제합니다. 충진층과 이를 구성하는 충진재(Resin, 레진)는 제재의 화학적/물리적 분리와 밀접한 연관성을 갖습니다.
고도로 발전된 고해상도 이미징 기술은 별도의 컬럼 분해나 절단을 거치지 않고도 이들의 복잡한 기하학적 구조와 특징들의 분석을 가능하게 했습니다. 특별히 본 글에서는 엑스레이 단층촬영 (X-ray tomography) 등을 이용해, 현재 상용화 된 크로마토그래피 컬럼들의 구조적 특징에 대해 알아보겠습니다.
본문에서는 아가로스(Agarose), 셀룰로스(Cellulose), 세라믹(Ceramic) 기반의 충진재에 대한 엑스레이 단층 촬영을 진행했으며, 공극률(Porosity)과 굴곡률(Tortuosity)에 대한 비교분석을 수행했습니다.
1. 충진층 이미징
미사용 충진 컬럼에 대한 단층촬영이 진행되었으며, 따라서 가장 온전한 상태의 충진재의 기하학적 구조를 밝히고자 하였습니다. 다음 사진은 3가지 충진 컬럼의 단층촬영 결과로, 물질의 명확한 구조적 차이를 볼 수 있는 사진입니다. 아가로스, 셀룰로스 레진은 구체인 반면 세라믹 입자는 구형과는 거리가 먼 모양을 보입니다.
아이오딘 펄스(Iodine pulse) 이미징을 통해, 컬럼 내벽과의 기하학적 또는 물리적 마찰에 의한 상호작용으로 인해 발생하는 충진 정도의 차이도 분석할 수 있습니다. 이 기법으로 컬럼의 가장자리와 중앙의 공극률과 굴곡률을 분석해보았을 때, 다음의 도표와 같은 결과를 얻을 수 있었습니다. 공극률의 경우, 세 종류의 충진재 모두에서 비슷한 비율로 컬럼 가장자리의 공극률이 감소한다는 사실을 확인할 수 있으나 셀룰로스 레진에서 가장 큰 차이를 보이는 것을 확인하였습니다.
굴곡률은 크로마토그래피에서 이동상이 통과하는 경로의 길이를 의미하므로, 컬럼의 성능을 평가하기 위한 또 하나의 중요한 척도가 될 수 있습니다. 이전까지는 굴곡률이 간접적으로 측정되었으나, 3D 이미징 기술을 통해 굴곡률에 대한 시뮬레이션이 가능해졌습니다. 해당 시뮬레이션 결과, 세 종류 레진에서 모두 컬럼의 가장자리보다 중앙의 굴곡률이 더 높은 것으로 분석되었습니다. 공극률과 동일하게, 셀룰로스 레진에서 중앙과 가장자리의 굴곡률 차이가 가장 크게 나타났습니다.
2. 충진층 압축
컬럼의 내경이 증가할수록 내벽의 마찰 지지(Frictional support)가 감소하게 되는데, 이는 셀룰로스 같이 약한 레진일수록 오염물질을 포함하고 있는 이동상과의 압축으로 이어집니다. 인위적인 압축 상황을 재현하기 위해 1ml 충진 컬럼 에 20% 에탄올을 일반 유속인 1CV/min과 초과 유속인 10CV/min으로 흘려 보내주어 실험을 진행했습니다. 다음 그림처럼, 초과 유속으로 이동상을 흘려주었을 때 컬럼의 충진재가 플라스틱 내벽과 분리되어 압착된 모습을 볼 수 있습니다.
위의 사진과 같은 3D 이미징 데이터를 수집하여 압착된 충진재의 공극률과 굴곡률을 측정하였습니다. 일반 유속과 초과 유속의 통과 전, 통과 중, 통과 후의 이미징 데이터를 분석한 결과는 다음의 도표와 같습니다.
실험 결과, 일반 유속에서는 공극률의 변화를 관찰할 수 없었지만 초과 유속 통과 중, 공극률이 눈에 띄게 감소한 것을 볼 수 있습니다. 이러한 현상은 이동상의 흐름이 멈추었을 때는 원상 복구되는 것을 보였습니다. 더하여, 굴곡률 또한 초과 유속에서 감소하였다가 이동상의 흐름이 멈추었을 때 일정 수준 복원되는 결과를 도출할 수 있었습니다.
3. 개별 충진재 이미징
충진재 자체의 내부 구조는 크기 배제 크로마토그래피(Size-exclusion chromatography)를 통한 분리정제에서 필수적인 고려 요소이며, 물질이나 불순물의 레진 결합률 예측에 필요한 표면적의 계산을 위해서도 필요한 정보입니다. 엑스레이 단층촬영을 통해 세 종류의 레진 입자에 대한 내부 구조를 확인한 이미지는 다음의 사진과 같습니다. 세 종류의 각 레진에서의 세공이 분명히 확인되고, 각각이 서로 다른 입체구조를 갖고 있음을 확인할 수 있습니다.
분리하고자 하는 생물학적 제재의 물리적, 화학적 특성(크기, 전하, 소수성 등)에 따라, 그리고 공정 변수에 따라 적합한 컬럼을 선택하는 것은 공정 설계에서 매우 중요하게 작용하는 변수라고 할 수 있습니다. 위의 분석 결과와 같이, 컬럼을 채우고 있는 충진재의 종류에 따라 입체 구조의 차이점이 존재하며 이는 곧 공극률과 굴곡률의 차이로 이어지고, 이는 다시 정제하고자 하는 생물학적 제재의 순도, 또는 물리/화학적 특성에 영향을 미치게 됩니다. 궁극적으로는 생산되는 약물의 약효에도 영향을 미칠 수 있으므로, 신중한 충진 컬럼의 선택이 필요합니다.
출처: Visualization and Characterization of Chromatography Structures: Imaging at Packed-Bed and Individual-Bead Sclaes (https://bioprocessintl.com/2023/october-2023-2023/visualization-and-characterization-of-chromatography-structures-imaging-at-packed-bed-and-individual-bead-scales/)