바이오 생산 설비, 관리법, 시험 공정 등은 의약품 생산 공정에서의 바이러스 오염 가능성을 차단하도록 발전해왔습니다. 의약품의 바이러스 오염의 일례로, 1980-90년대에 간염 바이러스 또는 HIV 바이러스가 혈장 제제를 통해 사람에게 다수 옮겨진 사례가 있습니다. 해당 시기에는 바이러스 제거 단계가 혈장 제제 공정에서 시행되지 않았고, 기부자의 혈액에 대한 바이러스 스크리닝법이 존재하지 않아, 많은 사람들이 죽음에 이르기도 했습니다.
바이오 의약품 공정은 바이러스나 미생물의 오염을 실시간으로 모니터링하고 예방할 수 있어야 합니다. 그러나, GMP 수준의 오염 검사는 약품의 공정 통과 시간보다 많이 소요되어, 오염에 대한 즉각적 대응이 어렵습니다. 또한 세포 배양 단계에 큰 영향을 미치지 않는 오염물질의 경우, 하위 공정으로 유입될 가능성이 더 큽니다. 한번 바이러스가 생물반응기(Bioreactor)의 하위 공정에 유입되면, 오염 범위가 전체 공정으로 확장됨과 동시에, 처치의 규모도 확대됩니다. 철저하게 설계된 하위 공정은 여러 단계에 걸쳐 오염 물질을 제거하지만, 엄격한 기준을 적용하여 오염원의 확실한 제거를 보장할 수 있어야 합니다.
생물반응기에서의 바이러스 검사는 빠르게 수행되므로, 오염 시 생산물이 하위 공정으로 이동하기 전에 빠른 조치를 취할 수 있습니다. 이 단계에서 시행되는 분석법으로, 고속분석 (Highthroughput sequencing, HTS)와 정량중합효소연쇄반응(quantitative polymerase chain reaction, qPCR) 실험법이 사용됩니다. qPCR 분석법은 검사하고자 하는 바이러스의 유전정보가 필요하지만, HTS는 유전정보를 알지 못하는 미지의 바이러스까지 감지가 가능하다는 장점이 있습니다.
바이오 의약품 생산자는 반드시 바이러스, 곰팡이, 박테리아와 같은 미생물의 감염에 대비하고 예방하기 위한 공정 프로토콜을 설계해야 합니다. 아래 표에 기재된 항목들을 그 예로 들 수 있습니다.
하위 공정에서의 바이러스 제거 평가
하위 공정의 바이러스 제거(Viral clearance, VC) 평가는 바이오 의약품의 중요한 안전성 요건입니다. ICH 5A 가이드는 모델 바이러스 또는 감염 가능성이 있는 바이러스종에 대한 VC 평가를 하도록 규정하고 있습니다. 예를 들어, 혈장 제제 산업의 경우 인간 유래 물질에 대하여 hepatitis C virus(HCV) 검사를 실시합니다.
VC 평가는 포유류 세포의 하위 공정 단계에서 발생할 수 있는 레트로바이러스 유사 입자(Retrovirus-like particles, RVLPs)의 제거 여부를 검사합니다. 이 검사는 RVLP 안전 계수를 결과로 도출하며, 제품 복용량에서 레트로바이러스의 이론적 양과 비교하여 바이러스의 제거가 적절하게 이루어졌는지 평가합니다. VC 평가는 하위 공정이 얼마나 다양한 타입의, 서로 다른 물리화학적 성질을 가진 바이러스를 제거하는지 평가함으로서 해당 공정의 완건성의 지표를 나타내기도 합니다. 일반적으로 VC 평가는 전문 업체에 외주를 맡기지만, 자체적으로 수행하는 경우도 있습니다.
ICH, PDA, BPOG, ISPE의 가이드라인 모두가 VC 평가의 필요성에 대해 언급하고 있으며 평가 결과를 해석하기 위한 방법론과 접근법에 대해서도 설명하고 있습니다. 일반적으로, RVLP의 비피막바이러스의 대표로 minute virus of mice (MVM)와, 피막바이러스의 대표로 xenotropic murine leukemia virus-related virus(X-MuLV)가 초기 임상 VC 평가의 모델로 사용됩니다. 후반부 임상의 VC 평가를 위해서는 최소 4가지 이상의 바이러스 모델이 필요하며, 일반적으로 X-MuLV와 MVM에 더하여 2-3가지 정도의 바이러스 모델을 추가합니다. 컬럼 수지(resin)에 대한 VC 평가에 사용되는 바이러스 모델은 피막의 존재 여부, DNA 또는 RNA 바이러스 여부 등을 조합해서 선택합니다. 이때 사용될 수 있는 다른 바이러스로는 reovirus type 3, bovine viral diarrhea virus(BVDV), vesicular stomatitis virus(VSV), Sindbis virus, pseudorabies virus(PRV) 등이 있습니다.
바이러스 대체물을 이용한 VC 평가 단순화
제약사는 약품에 존재하는 바이러스의 양과 상관없이, 오염된 원료는 반드시 폐기해야 합니다. VC 평가로 얻을 수 있는 것은 무지 중 운영 환경에 의해 공정이 바이러스에 노출될지라도 바이러스가 환자에게 전달되지 않는다는 보장입니다. 현대의 바이오 의약품 생산 공정은 피막 바이러스의 불활성화 단계들을 포함하는데, 강산 시약, 계면활성제, 고농도 아르지닌, 음이온 교환 크로마토그래피, 바이러스 필터 등이 사용됩니다.
일반적으로 정제 전 세포배양액에서 바이러스, 마이코플라스마, 박테리아, 곰팡이 등의 오염도 검사를 시행하는데, 이 결과는 생산 공정의 종료 후에 확인되기도 합니다. 이와 다르게 VC 평가는 하위 공정 전체에서 광범위한 바이러스 종의 불활성화 및 제거가 이루어지는지 빠르게 확인합니다.
VC 평가 연구가 완료되기까지는 수 개월이 걸리기도 합니다. 중요한 VC 연구의 경우 수백만 달러의 비용이 발생하기도 하고, 그만큼의 수행 인력 투입이 필요합니다. 그러나 환자의 안전성을 보장하기 위해, VC 연구에 투자하는 시간과 비용은 불가피합니다.
중요한 VC 연구는 높은 생물안전레벨을 가진 전문화된 연구실에서, 최소 4가지의 포유동물성 바이러스에 대한 검사를 진행해야 합니다. 임상 초기와 후기의 바이러스 패널은 공통적으로 X-MuLV와 MVM을 포함해야 합니다. 둘 다 CHO 세포 감염 가능성이 있는 바이러스입니다.
그러나 이들 바이러스만 사용하는 것은 아니고, 아래와 같은 비포유동물 바이러스를 피막 또는 비피막 바이러스의 대체물로 사용하기도 합니다.
다른 대체물 중 하나로, 바이러스 유사 입자 (virus-like particles, VLPs)를 사용할 수 있습니다. VLP는 자가조립이 가능하며, 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 포함한다는 장점을 갖고 있습니다. VLP는 종류에 따라 피막 보유를 선택할 수 있습니다. 이들은 바이러스를 모사하기도 하나, 숙주 세포 감염에 필요한 유전물질은 포함하지 않아 VC 연구에 유용하게 사용할 수 있습니다.
MVM의 대체 바이러스, øX-174
MVM과 øX-174는 유사한 사이즈와 등전점, 내약품성을 가진 비피막성 바이러스입니다. øX-174는 포유세포에 감염되지 않으며, enterovirus, parvovirus와 비슷한 내약품성을 가지며 adenovirus serotype 5나 poliovirus 보다는 생리화학적 내성이 높기 때문에 바이오 의약품의 무결성을 검사하기 위해 사용됩니다.
이와 같은 특성을 고려하였을 때, øX-174가 특정 조건에서는 MVM의 대체물로서 사용될 수 있습니다. 설계된 공정에서 두 바이러스가 분리되어 같은 조건에 존재하지 못한다면, MVM 모사 바이러스 입자 (MVM Mock virus particle, MVM-MVP)와 같은 VLP가 적절한 대용물로서 사용될 수 있습니다.
MVM과 øX-174의 유사한 크기는 나노여과공정(Nanofilteration process)의 평가의 대체물로서도 사용될 수 있음을 보여줍니다. 보통 PP7과 øX-174가 작은 포유동물 바이러스의 나노여과공정의 대체제로 사용되는데, 둘은 MVM보다 취급하거나 연구하기 용이하여 매력적인 대체제로 사용됩니다.
나노여과공정의 VC 연구는 4개 이상의 복잡한 바이러스 모델들을 사용하는 대신, MVM 또는 MVM 대용을 사용하여 단순화될 수 있습니다. 나노여과공정의 경우 크기에 기반하여 바이러스를 제거하며, 막 구멍의 크기보다 큰 바이러스 입자를 여과합니다. Parvovirus나 작은 박테리오파지의 경우 나노여과공정 평가의 모델로서는 적절하지 않은데, 이들의 크기가 표준 필터 구멍의 크기보다 아주 유사하여 결과가 정확하지 않기 때문입니다. 따라서 MVM, MVM-MVP 대체물, øX-174 또는 다른 유사한 크기의 박테리오파지에 대한 제거율을 VC 평가의 결과로 사용하는 것이 바람직합니다.
MVM-MVP, øX-174 등은 VC 크로마토그래피 단계에서도 MVM 대용으로 사용할 수 있습니다. 이들을 활용한 실험 계획(design of experiment, DoE)를 도입하여 VC에 최적인, 또는 최악인 크로마토그래피 조건에 대한 연구가 진행된 바 있으며, 음이온 교환 크로마토그래피 (Anion exchange chromatography, AEX), 소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophobic interaction chromatography, HIC), Protein A 친화성 크로마토그래피 등에서 유의미한 결과를 얻은 사례가 있습니다.
X-MuLV의 대체 바이러스, Baculovirus / ø6, ø13
Baculovirus (200-450nm)와 X-MuLV (80-120nm)는 비피막성 바이러스들에 비해 낮은 내약품성을 보이지만, Baculovirus는 산성 용액, 계면활성제, 용매/세제 처리 등에서 X-MuLV 보다 높은 저항성을 가집니다. pH 3.0 용액에서 1시간을 생존할 수 있으며 pH 12.0에서는 10분 정도를 생존할 수 있습니다. 또한 55℃에서 90분을 견딜 수 있습니다. Baculovirus의 뛰어난 내약품성은 VC 연구에 사용될 차선책으로서 적합함을 보여주며 크기 또한 일반적인 바이러스 연구에서 많이 사용되는 PRV(150-200nm)와 비슷하다.
용해성 피막 박테리오파지인 ø6와 ø13은 모양(20면체)과 크기(~80-85nm)가 X-MuLV와 비슷합니다. 따라서, 이들 파지는 나노여과공정에서의 X-MuLV의 대체제로서 고려해볼 수 있습니다. ø6 비리온(virion)의 경우 계면활성제와 클로로포름에 취약하며, pH 6.0과 9.5 사이에서 안정성을 보입니다. 그러나, 이들이 단백질 생물학에 필요한 바이러스 불활성화 공정에 사용되었을 때 도출되는 계면활성제, 용매, pH 조건에 따른 반응성에 대한 데이터는 아직 부족한 상황입니다.
생리화학적으로 비교하였을 때, ø6와 ø13은 크로마토그래피 또는 바이러스 불활성화 단계에서 X-MuLV의 대체물로서 사용되기에 적합함이 확인되었지만, 비감염성 RVLP가 더 나은 대안이 될 수도 있음을 고려해야 합니다.
하위 공정에서의 미생물 오염 방지책
지난 20년간 공정 설비가 발전했지만, 공정의 오염은 여전히 발생하고 있습니다. 바이러스 오염은 드물게 일어나는 경향이지만, 오염 발생 시 치르게 되는 비용은 최악의 경우 수백억대를 초과하기에 주의를 기울여야 합니다. 현재의 하위 공정은 완전한 밀폐가 불가능해, 무균 상태의 공정 진행이 불가능합니다. 그러나 전체적인 멸균 과정은 크로마토그래피 수지의 특성과 성능을 변질시킬 수 있고, 컬럼은 완전히 포장된 상태가 아니기에 멸균된 수지 또한 장기간 사용시 멸균 상태로 유지된다는 것을 보장할 수 없습니다. 따라서 하위 공정 전체를 멸균하거나 밀폐된 상태로 유지할 수 없기 때문에, 공정 자체 시스템을 밀폐된 공간에서 수행하거나 주위 환경을 통제할 수밖에 없게 됩니다.
다수의 비피막성 바이러스의 불활성화 조건은 단백질이 안정할 수 없는 극한의 물리화학적 조건입니다. 이들은 극단적인 pH와 고온, 화학물질에도 내성을 갖습니다. Paravovirus의 경우 80-90도의 온도에서도 10분간 생존할 수 있으며 2500ppm의 NaOCl에서도 견딜 수 있습니다. NaOCl 처리는 같은 비피막성 바이러스라도, MVM과 poliovirus는 완벽히 불활성화 할 수 없지만, adenovirus나 vaccinia에는 효과적으로 작용하기도 합니다. 에탄올 또한 vaccinia와 adenovirus에는 효과적으로 작용하지만 polivirus나 parovovirus에는 활성을 보이지 않습니다. 따라서, 공정 설계의 최적화를 통해서는 모든 비피막성 바이러스를 완전히 불활성화할 수 없고, 설비 환경의 통제를 통해 유입을 막는 것이 가장 효율적이라고 할 수 있습니다.
박테리아 또는 곰팡이 오염의 경우 바이러스 오염보다 자주 발생합니다. 2019년에서 2021년까지, 의약품 생산 공장들은 이러한 미생물의 오염으로 인해 175개 배치를 회수하였습니다. 숙주가 없으면 증식하지 못하는 바이러스와 다르게, 박테리아와 곰팡이는 공정에 유입되는 순간부터 증식하기 시작해 박멸하기 어렵습니다. 예를 들어, Bacillus 균주의 경우 열과 유기 용매에 내성을 갖는 포자를 형성하여 영양소가 없는 상태에서도 증식합니다. 이러한 포자는 보통 110-130도의 습열로 20-40분간 가열하여 비감염화 처리를 하지만 이러한 조건에서는 단백질류의 생산물이 파괴됩니다.
다행히도, 다수의 활성 박테리아와 곰팡이는 생산물이 안정한 조건에서 사멸시킬 수 있다. 폴리올(글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등)을 완충액에 18% 이상으로 희석하여 처리하면, 박테리아와 곰팡이를 살균할 수 있습니다. 폴리올 용액의 항균효과는 미국약전 51장에도 보고되었습니다. 이 외에도 방부제, pH 조절 등의 방법을 선택하여 향상된 항균효과를 적용할 수 있습니다.
폴리올은 단백질의 안정화 효과를 보이며 단백질의 응집이나 변성을 막는 성질을 갖고 있습니다. 그러나, 이온 교환 크로마토그래피 수지와 단백질의 결합력에도 영향을 끼치므로, 폴리올 도입은 하위 공정 설계에서 종합적으로 고려되어야 합니다.
본문을 통해 바이오 의약품 생산 공정에서의 바이러스 제거를 위한 분석법의 필요성과 효과적인 제거 공정 도입의 필요성을 정리해보았습니다. 환자의 안전을 위해, 그리고 제약사의 무의미한 시간과 비용 소모를 방지하기 위해 효율적이고 철저한 공정 설계는 필수적이라고 할 수 있겠습니다.
참고문헌 : Microorganism Contamination in Downstream Biopharmaceutical Processes: A Holistic Approach to Measurement, Control, and Prevention, BioProcess International (https://www.bioprocessintl.com/separation-purification/microorganism-contamination-in-downstream-biopharmaceutical-processes-a-holistic-approach-to-measurement-control-and-prevention)