유세포 분석기는 단일 세포의 크기와 내부 복잡성, 또는 표면 단백질 등의 물리/생리학적 특성을 파악할 수 있는 정밀한 기기로, 제약 바이오 분야에서 널리 사용되고 있습니다. 주로 형광 염료를 통해 방출된 빛을 분석하여 특성을 파악하며, 짧은 시간 안에 많은 수의 단일 입자를 확인할 수 있습니다.
이러한 장점은 의약품의 개발 단계에서의 치료제의 효능과 생체 내 영향 분석 뿐만 아니라, 공정 설계 단계에서 사용되기도 합니다. 특히 세포 기반 제품과 같은 생물학적 제제의 공정 개발 및 품질 평가에 적용할 수 있으며, 이를 통해 제품의 특성을 확인하며 공정의 일관성을 확보하여 분리/정제 공정의 안정성을 검증할 수 있습니다.
앞으로 두 차례에 걸쳐, 유세포 분석기의 기본 구성과 원리, 적용 가능 분석법에 대해서 알아보고자 합니다. 특별히 오늘 본문에서는 유세포 분석기의 구성 단위와 작동 원리에 대해 먼저 정리해보겠습니다.
유세포 분석기의 기본 원리
유세포 분석기는 크게 두 종류로, 분석만 가능한 장비와 분석 결과에 기반해 입자의 분류까지 가능한 장비가 있습니다. 흔히 FACS라고 말하는 장비 또한 유세포 분석기의 일종으로 분류 기능까지 포함한 장비를 말합니다.
유세포 분석기의 기본 구성은 유체 시스템, 광학 시스템, 전류 장치, 컴퓨터로 구분할 수 있습니다. 유체 시스템은 시료에 담긴 입자들을 유체의 흐름을 따라 광초점으로 이동시키는 역할을 수행합니다. 광초점으로 조사된 빛은 입자에 부딪혀 산란되며, 이렇게 산란 또는 방출된 빛은 검출기를 통해 감지되어 전기 신호로 변환됩니다. 변환된 전기 신호는 디지털 데이터 형태로 이동하여 컴퓨터로 계산되며, 계산 후 비로소 작업자가 보고자 하는 형태의 데이터로 도출할 수 있습니다.
유세포 분석기는 세포라는 하나의 입자를 분석하기도 하지만, 조금 더 자세히 보고자 한다면 세포막, 세포질, 핵에 있는 물질을 분석할 때도 유용하게 사용될 수 있습니다. 단순 단백질뿐만 아니라 세포 기관, 핵산, 사이토카인, 호르몬 등에 대한 확인도 가능합니다. 이러한 특성 분석 기능을 이용한다면 세포 주기, 세포 분열과 같은 변화의 관찰과 칼슘의 흐름이나 막 포텐셜까지도 측정할 수 있게 됩니다.
유세포 분석기의 구성 단위
1) 유체 시스템
유체 시스템은 세포들이 기기 내에서 이동할 수 있게 하는 물리적인 역할을 수행합니다. 유체 시스템의 구성 요소로는 유세포 분석용 완충액(Sheath fluid)와 압축 공기 라인(Pressurized airline)이 있습니다. 유체 분석용 완충액은 쉽게 말해 PBS와 같은 희석액이라고 할 수 있으며, 압축 공기 라인 옆에 위치한 유체 챔버로 세포를 이동시킵니다. 반면, 압축 공기 라인은 시료가 유체 챔버에 흐를 수 있도록 압력을 가하는 역할을 하며, 시료의 흐름을 중심으로 완충액이 그 주변으로 흐르는 구조를 유지할 수 있도록 적절한 압력차를 유지합니다.
시료의 유압은 항상 완충액의 유압보다 높아, 세포가 단일층으로 나란히 흐를 수 있도록 유지합니다. 이때 시료의 유속은 분석 목적에 맞게 조절합니다. 일반적으로 면역형 분석(Immunotyping) 같이 대량 분석이 필요한 경우에는 빠른 유속을 선택하며, DNA 함량 분석 시험과 같이 높은 해상도를 원하는 경우에는 유속을 낮추어 분석의 정확도를 올릴 수 있습니다.
정확한 입자 분석을 위해서는 최적의 유체 조성을 선택하는 것도 중요한 고려사항이 될 수 있습니다. 또한 작업자는 항상 유체에 기포나 잔여물은 없는지, 적절한 압력이 유지되고 있는지를 확인하여 분석 오차 발생 가능성은 없는지 감독해야 합니다.
2) 광학 시스템
광학 시스템은 레이저, 렌즈, 광자 감지기로 이루어져 있습니다. 렌즈는 레이저의 모양과 초점 등을 조절하는 역할이며, 렌즈를 통과한 레이저는 전자를 고에너지 궤도로 올려 빛을 방출하게 합니다. 광자는 이 궤도의 전자가 다시 낮은 에너지 궤도로 떨어질 때 생성되며, 빛은 세포에 부딪힌 다음 굴절되어 분산됩니다. 빛의 분산에 영향을 줄 수 있는 요인은 세포막, 핵, 세포 내부 구조의 복잡성, 세포 모양과 표면 형태 등이 있습니다. 분산된 빛은 일반적으로 다음의 표, 그림과 같이 두 종류로 구분할 수 있습니다.
사용하고자 하는 형광 염료의 종류에 따라, 다양한 레이저 조성을 이용할 수 있습니다. 아르곤 레이저(488nm)의 경우, FITC나 phytoplankton과 같은 염료처럼 높은 파장의 빛을 방출할 때 사용할 수 있습니다. 대다수 유세포 분석기는 이에 더한 추가 레이저로 UV(300-400nm) 또는 red diode(630nm)를 장착하기도 합니다.
빛을 수집하는 광학기기는 여러 렌즈들과 광학 거울, 그리고 필터로 구성되어 있습니다. 렌즈는 빛을 모으기 위해 사용되며, 광학 거울로 반사된 빛은 특정 파장의 빛을 선택적으로 통과시키는 필터를 지납니다. 특정 파장의 형광을 감지하기 위한 검지기의 특이도는 적합한 필터의 장착 여부와도 연관이 있습니다. 필터의 종류는 세 종류로, 대역 통과 필터(band pass filter)는 특정 파장의 형광만 통과 시켜 감지기에 도달할 수 있게 하며, 단파장 통과 필터(Short pass filter)와 장파장 통과 필터(Long pass filter)는 각각 특정 파장보다 같거나 짧은 파장, 특정 파장 보다 같거나 긴 파장을 통과시킬 수 있는 특성을 가집니다.
3) 분석 시스템
유체를 통과한 레이저는 광감지기에 의해 전압 신호로 바뀝니다. 두 종류의 감지기 중, 광다이오드(Photodiode, PD)보다 광증배관(Photomultiplier tube, PMT)이 더욱 민감하며, 빛을 보다 효율적으로 광자 신호로 변환합니다. 따라서, PD는 FSC를 통해 발생한 강한 빛 신호를 감지하며, PMT의 경우 SSC나 형광 신호를 통해 발생한 더 약한 신호를 감지합니다. PMT와 PD를 통해 포집된 광신호는 전자의 수에 비례하여 전류 신호를 생성하고, 이는 증폭기를 거쳐 전압 펄스로 변환됩니다.
이렇게 변환된 아날로그 전류 신호는 두 가지의 증폭기인 선형 증폭기와 대수형 증폭기를 거쳐 컴퓨터를 통해 디지털 신호로 바뀌어 입력됩니다. 디지털 신호를 도표 또는 히스토그램 형태로 가시화하면, 우리가 흔히 접하는 유세포 분석기의 데이터가 됩니다.
구성 단위에서부터 보이듯, 유세포 분석기는 빛의 굴절과 산란을 이용하는 분석 기기입니다. 아무런 염색 없이, 유세포 분석기가 기본적으로 보유하고 있는 레이저만으로도 FSC, SSC 분석을 통해 여러 세포의 특성들을 확인할 수 있습니다. 하지만, 여러 종류의 형광 물질을 이용한다면 더욱 자세하고 작은 단위의 정보들까지도 수집하고 조사할 수 있습니다.
이어질 다음 글에서는 형광 물질을 이용하여 세포 분석을 하는 원리와 이를 통해 수집된 데이터의 분석법, 그리고 유세포 분석기를 이용하여 수행할 수 있는 실험들에 대해서 더 정리해보겠습니다.
참고 문헌 : Adan A, Alizada G, Kiraz Y, Baran Y, Nalbant A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 2017 Mar;37(2):163-176. doi: 10.3109/07388551.2015.1128876.