지난 글에서는 시료를 질량 분석에 적합한 이온 형태로 변환하는 이온화 장치의 종류와 원리에 대해서 알아보았습니다. 본 글에서는 이온화 장치의 다음 단계로 시료가 통과하게 되는 질량 분석기의 종류와 그에 따른 원리를 소개하려고 합니다.
여러 종류의 질량 분석기를 비교하기 전에, 분석의 ‘정밀도’와 ‘정확도’의 의미의 차이를 이해할 필요가 있습니다. 질량 분석법에서의 정밀도는 해상도와 관련이 있습니다. 현미경에서의 해상도는 두 물체의 사이의 거리를 기반으로 정의한다면, 질량 분석법의 해상도는 질량 분석 그래프에서 나타나는 여러 peak 사이의 거리를 바탕으로 정의합니다. 질량 분석의 해상도는 m/△m으로 표현되며, 여기에서 m은 peak에 해당하는 질량, 그리고 △m은 두 peak 사이의 질량 차이를 의미합니다. 쉽게 정리하자면, 질량 정밀도(해상도)는 상대적으로 질량이 매우 비슷한 두 이온을 비교할 때 이를 분리하여 분석할 수 있는가에 대한 척도로 볼 수 있습니다. 한편, 질량 정확도는 이온의 특성 결정과 관련되어 있으며, MS를 통한 질량의 측정치와 이론상 시료의 질량이 얼마나 유사한지를 뜻합니다. 이 개념을 갖고, 질량 분석기의 종류에 대해서 알아보겠습니다.
현재 사용되고 있는 질량 분석기의 종류는 5가지로 구분되며, 이들은 분석 원리에 따라 빔 분석기와 트래핑 분석기로 나눌 수 있습니다. 먼저 살펴볼 빔 분석기는 5가지 중 3가지의 질량 분석기를 포함하고 있으며, 시료의 이온이 이온화 장치에서 빔을 타고 날아가 분석장(analyzing field)을 지나, 검출기(detector)에 도달하며 분석되는 과정을 거칩니다.
Time-of-flight (TOF)
TOF에서, 시료 이온은 이온화 장치에서 동시에 출발하여 고정 압력으로 TOF drift tube에 주입됩니다. 이때, 같은 전하를 가지는 이온은 같은 운동에너지를 얻고, 낮은 m/z값을 가지는 이온일수록 빠른 속도로 측정기를 향해 이동합니다. 각 이온이 가속화된 후에는 TOF drift tube의 고정된 거리(0.5-2.0미터)를 비행하여 검출기에 도달하고, 이에 걸리는 시간을 측정해 계산하면 m/z값을 도출할 수 있습니다.
TOF는 이온 주입이 펄스 패턴으로 이루어진다는 특성 때문에, 이온이 연속적으로 생성되는 기존 이온화 방법들과 호환이 어렵다는 단점을 가졌습니다. 그러나 MALDI와 같은 펄스형 이온화 장치가 등장하면서 최근 재부상하기 시작하였고, 현재는 MALDI와 호환되어 많이 사용되고 있습니다. TOF는 이론상 분석할 수 있는 질량의 한계가 존재하지 않기에, 수십만의 m/z값을 가진시료도 분석이 가능하다는 장점을 갖고 있습니다.
위의 원리로 작동하는 선형 TOF보다 정밀하게 발전한 TOF 분석기는 이온 반사기 (reflectron)가 있어, 이온이 주입된 후 정전 거울 (electrostatic mirror = reflectron)에 반사되어 검출기에 도달하는 방식을 채택합니다. 이온 반사기의 역할은 동일한 m/z값 이온들의 미세한 속도차를 보완하는 역할을 하며, 여러 변수들에 발생한 속도차를 보정하여 TOF의 해상도를 높이기 위한 목적으로 탄생하였습니다.
Sector
모든 sector는 자기장 sector를 갖고 있으며, 일부는 전기적 sector도 포함하고 있습니다. 이온은 자기장 sector를 따라 곡선을 그리며, 그리고 자기장 중심과 일정한 반지름을 유지하며 비행합니다. 자기장 세기와 가속화 전압을 고정시키면, 특정 m/z값을 가지는 이온만 슬릿을 통과하게 할 수 있으며, 자기장 sector는 이 이온들을 그들의 운동량에 따라 프리즘처럼 분산시키는 역할을 합니다. 같은 운동량을 가진 이온들끼리 고유한 각도에 따라 분산되어 슬릿을 통과하도록 하는데, 이 과정을 방향 집중화 (direction focusing) 라고 합니다. 질량 스펙트럼은 서로 다른 m/z값을 갖는 이온들이 두 개의 슬릿을 통과하는 자기장 세기를 스캔하여 얻어지고, 해상도는 이온의 속도 차이에 따라 결정됩니다.
Sector 분석기의 성능을 향상시키기 위해 자기장 sector의 전후로 전기장 sector를 배치하기도 하는데, 전기장 sector는 이온을 그들의 역학적 에너지와 전하의 비에 기반하여 분산시킵니다. 모든 이온들은 이론상 동일한 운동 에너지를 갖고 있기에, 전기장 sector에서 동일한 경로를 가지며 자기장 sector처럼 질량을 분석할 수는 없지만 동일한 방향으로의 수렴을 유도할 수 있습니다. 그러나, 이온이 전기장 sector에 들어가는 미세한 속도차로 인해 이온들의 미세한 분산이 발생하며, 이중 sector 장치를 통해, 전기장 sector에서 이루어지는 운동 에너지 분산을 자기장 sector의 가속도 분산으로 보정할 수 있습니다. 따라서 이중 sector 장치에서는 속도 집중화 (velocity focusing)와 방향 집중화가 모두 가능하여 방향과 속도차를 극복하고 동일한 m/z값을 가지는 이온이 같은 포인트로 집중될 수 있게 합니다. 이렇게 이중 sector를 이용한다면 질량 해상도가 수천 수만에 이를 수 있으며, 최고 계기를 사용하면 십만 이상으로도 높아질 수 있고, 따라서 낮은 ppm 범위의 질량 해상도를 얻을 수 있게 됩니다.
Quadrupole
Quadrupole은 가장 널리 사용되는 방식의 질량 분석기이며, GC, LC와 병용하여 많이 사용됩니다. 낮은 전압으로 이온을 가속화하며, TOF나 sector보다 장비의 크기가 작다는 것이 장점입니다. 이온은 quadrupole 내의 동적 전기장(dynamic electric field)에서 무선 주파수에 의한 이온 운동을 기반으로, 이온의 m/z값에 따라 분리됩니다. 이온 자체가 갖는 운동에너지가 TOF와 sector에서 중요한 변수로 작용하는 반면, quadrupole에서는 큰 영향을 미치지 않습니다.
이 장비에서는 4개의 원통형 전극을 통해 흐르는 직류 전압과 무선 주파수의 전압을 통해 질량 분석이 시행되는데, 시간의 흐름에 따라 변화하는 무선 주파수에 의해 발생하는 이온의 운동과 시간과의 상관관계 공식에 따라 질량이 도출됩니다. 이 계산법이 TOF나 sector의 계산법보다 훨씬 간단하며, quadrupole에서 사용되는 표현법인 Mathieu stability diagram은 어떤 이온이 quadrupole을 통과해 검출기로 이동하는지, 어떤 이온이 그렇지 않은 지 직관적으로 이해할 수 있게 합니다. 해당 그래프는 무선주파수 전압과 직류전압을 변수로 취하며, 또 다른 변수로는 quadrupole의 물리적 크기, 무선주파수의 진동수, 관심 이온의 m/z값 등을 사용할 수 있습니다.
일반적으로는 quadrupole의 크기와 무선주파수의 진동수를 고정하고, 주파수(radio frequency, rf)와 직류 전압(direct current, dc)을 증가시켜 다양한 m/z 값의 이온들이 순차적으로 검출기에 도달하게 하여 분석이 진행됩니다 (보통 rf와 dc의 비율을 일정하게 유지). 사분극의 크기에 따라, 분석할 수 있는 m/z값의 최고치는 300에서 4000으로 다양합니다. 질량 정확도는 수백ppm 범위이며, 질량 해상도는 rf와 dc에 따라 달라지고 전체 질량 범위가 곧 단위 해상도가 됩니다. 그러나 대부분의 기기에서 해상도가 증가할수록 민감도는 감소하기에 높은 m/z값의 이온을 분석할 때 민감도가 떨어질 가능성을 고려해야 합니다.
위와 같은 빔 분석기와 다르게, 트래핑 분석기의 경우 이온이 비행하지 않고, 분석장에 갇힌 상태로 분석이 진행되는 형태의 분석기를 의미하며, 다음과 같은 두 종류의 질량 분석기가 속해 있습니다.
Quadrupole ion trap
위에서 언급한 quadrupole 질량 분석기와 유사한 원리를 갖고 있지만, 비행 상태의 이온이 아닌 전기장에 트랩된 이온이 분석된다는 점에서 차이가 있습니다. Quadrupole은 2차원의 전기장(x, y축)을 갖고 있고 이온이 수직(z축)으로 이동하는 흐름을 갖고 있습니다. 3차원의 전기장으로 이루어진 이온 트랩 안에 이온이 갇히게 되고, stability diagram은 quadrupole과 동일한 방식으로 트랩된 이온을 분석/기록합니다. 하지만 가장 중요한 차이점은, quadrupole에서의 이온은 안정한 궤도를 갖고 이를 통과한다는 점이며, quadrupole 이온 트랩에서는 이온의 궤도가 불안정한 상태에서 질량 스펙트럼을 얻는다는 점입니다. 이때 이온을 불안정화 시키기 위해 가하는 rf 또는 dc를 높여, 분석하고자 하는 이온의 질량을 선택하는 방식을 적용합니다. 이렇게 분석하고자 하는 특정 질량을 선택할 수 있다는 점이 quadrupole의 장점이라고 할 수 있습니다.
일반적 이온 트랩의 경우 분석 가능한 m/z값의 범위와 해상도가 quadrupole과 비슷합니다. 그러나 해상도는 rf/dc 비율을 느리게 설정하여 크게 향상될 수 있으며 분석 가능 질량 범위를 7만까지 향상시킬 수 있습니다. 또한 높아진 m/z에서도 민감도가 크게 하락하지 않고 질량 정확도도 유사한 수준으로 유지됩니다. Quadrupole ion trap이 가진 민감도, 처리량, 쉬운 작동법 그리고 저비용 등의 장점으로, 널리 사용되고 있습니다.
Fourier-transform ion-cyclotron resonance (FT-ICR)
Fourier-transform mass spectrometer (FTMS)라고도 불리는 이 장비는 sector와 유사한 원리를 가진 장비로, 이온의 m/z값을 결정하기 위해 자기장을 이용합니다. 그러나 자기장 sector와 가장 다른 점은 이온의 운동 에너지입니다. 자기장 sector의 경우 이온이 keV 범위의 운동 에너지를 갖지만, FT-ICR 이온의 경우 그보다 훨씬 작은 eV 범위의 운동 에너지를 갖습니다. 낮은 운동 에너지의 이온은 자기장을 통과하지 못하고 갇히게 되며, 일정한 자기장에서 m/z값에 따른 입자 가속기 진동수로 진동 운동 상태를 유지합니다. 이때 이온의 진동수가 정확히 측정되고, m/z값으로 환산되어 질량을 분석하는 원리입니다. 덕분에 높은 질량 해상도를 갖게 되었으며, 이는 FT-ICR의 장점으로 꼽힙니다. 질량 해상도 뿐만 아니라 질량 정확도 또한 ppm 레벨 아래로 내려갈 만큼 매우 높지만, 이 때문에 기기의 크기가 매우 크며 가격대가 높고, 다른 기기들에 비해 처리량도 매우 작은 편이라 사용도 측면에서는 Quadrupole ion trap보다 낮습니다.
여기까지, 크게 2가지의 작동 원리로 나뉘는 5종의 질량 분석기에 대해서 소개해보았습니다. 다음 글에서는 MS를 직렬로 연결하여 사용하는 분석법과, 해당 분석법에 이용되는 기기들에 대해서 알아보겠습니다.
참고 : Glish, G., Vachet, R. The basics of mass spectrometry in the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov 2, 140–150 (2003). https://doi.org/10.1038/nrd1011